Eiweiß

Abbildung zeigt ein DNA-Gerüst, das zwei Proteine ​​während der akustischen Kraftspektroskopie dicht beieinander hält [Vladimir Kunetki]

Temporäre Protein-Protein-Bindungen sind für Prozesse wie enzymatische Reaktionen, Antikörperbindung und Reaktion auf Medikamente unerlässlich. Die Fähigkeit, diese Bindungen genau zu charakterisieren, ist wichtig, um die Leistung potenzieller Therapien zu testen. Die derzeit verfügbaren Methoden hierfür sind jedoch nur begrenzt in der Lage, entweder Informationen auf der Ebene einzelner Bindungen bereitzustellen oder eine große Anzahl von Bindungen zu testen.

Forscher des Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) und ihre Kollegen haben nun eine besser zugängliche Methode vorgestellt, um die Stärke und Dauer von Protein-Protein-Bindungen unter ähnlichen Belastungen zu messen, wie sie sie in unserem Körper erfahren würden. Die Methode nutzt Schallwellen, um gebundene Proteine ​​auseinanderzuziehen, und DNA-Leinen, um die beiden Proteine ​​eng beieinander zu halten, sodass sie sich wieder verbinden können, nachdem ihre Verbindung unterbrochen wurde. Mit dieser Innovation können dieselben Proteinbindungen bis zu 100 Mal erneut getestet werden, was wertvolle Erkenntnisse darüber liefert, wie sich die Bindungsstärke mit zunehmendem Alter der Moleküle ändert. Diese Fähigkeit könnte neue Informationen über die Halbwertszeit von Medikamenten oder Antikörpern liefern.

Der leitende Autor Laurent Limozin, PhD, ein CNRS-Biophysiker, und seine Kollegen berichteten im Biophysical Journal über ihre Arbeit („Kombination von DNA-Gerüsten und akustischer Kraftspektroskopie zur Charakterisierung einzelner Proteinbindungen“) und erklärten: „Dieser Grundsatzbeweis ist etabliert.“ zwei Proteinbindungen von biomedizinischem Interesse, die vielversprechende Perspektiven für biotechnologische und medizinische Studien eröffnen.“

Die Bindungseigenschaften von Biomolekülen, die biologische Phänomene steuern, seien für die Bewertung von Therapeutika relevant, erklärte das Team, es seien jedoch neue experimentelle Werkzeuge erforderlich, um den Bruch von Proteinbindungen unter Krafteinwirkung auf multiplexierte Weise zu charakterisieren. „Während Massenmessungen an Populationen von Molekülen nach wie vor die Standardcharakterisierungstechniken sind, hat sich die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (SMFS) an einzelnen Paaren interagierender Partner als leistungsstarke ergänzende Strategie herausgestellt, da sie auf einzigartige Weise Zugang zur Reaktion einzelner Bindungen auf Kraft bietet.“

Für ihre neu veröffentlichte Studie kombinierten Limozin und Kollegen erstmals DNA-Gerüste mit akustischer Kraftspektroskopie (AFS), um die Kraftreaktion einzelner biomolekularer Komplexe zu messen. Mithilfe der akustischen Kraftspektroskopie können viele Molekülpaare gleichzeitig getestet werden, und die DNA-Gerüste ermöglichen die wiederholte Prüfung derselben Bindungen.

„Wir wollten eine Methode vorschlagen, die ausreichend modular ist, um auf verschiedene Arten von Bindungen angewendet zu werden, die einen angemessenen Durchsatz hat und eine hohe molekulare Präzision erreicht, die derzeit nur mit sehr ausgefeilten Techniken wie optischen oder magnetischen Pinzetten erreichbar ist, die häufig verwendet werden.“ „Für Laien schwer zu verstehen“, sagte Limozin.

Bei der akustischen Kraftspektroskopie werden Paare gebundener Proteine ​​in einer mit Flüssigkeit gefüllten Kammer getestet. Die Proteine ​​werden durch ein DNA-Gerüst zurückgehalten, sodass ein DNA-Strang das erste Protein am Boden der Kammer befestigt, während ein anderer Strang das zweite Protein an einer kleinen Silikatperle befestigt. Wenn die Forscher die Kammer mit einer Schallwelle beschallen, zieht die Kraft der Welle die Siliziumperle – und das Protein, an dem sie befestigt ist – vom Boden der Kammer weg. Wenn die Kraft stark genug ist, reißt dieser Zug die Bindung zwischen den beiden Proteinen auf.

Bei der neuen Methode dient ein dritter DNA-Strang als Leine, um die Proteine ​​nach dem Aufbrechen ihrer Bindung eng zusammenzuhalten. „… wir stellen die Kombination eines modularen DNA-Gerüsts, nämlich junctured-DNA (J-DNA), mit AFS vor, einer aufkommenden parallelen Methode, die potenziell einen großen dynamischen Bereich der schnellen Kraftanwendung bietet“, schrieben die Wissenschaftler. „Der untersuchte Proteinkomplex wird über Kilobasenpaare lange DNA-Schäfte, die durch die Leine verbunden sind, sowohl an der Oberfläche der Durchflusszelle als auch an einer Perle befestigt.“

„Die Originalität unserer Methode besteht darin, dass man zusätzlich zu diesen beiden Strängen auf jeder Seite in der Mitte eine Leine hat, die die beiden Stränge verbindet und die Proteine ​​beim Bruch zusammenhält“, erklärt Limozin. „Ohne diese Leine wäre die Ablösung irreversibel, aber dadurch kann man die Messung fast beliebig oft wiederholen.“

Als Proof of Concept nutzte das Forschungsteam die Technik, um zwei Einzelmolekülinteraktionen von biomedizinischem Interesse zu charakterisieren – die Bindung zwischen Proteinen und Rapamycin, einem immunsuppressiven Medikament, und die Bindung zwischen einem Einzeldomänen-Antikörper und einem HIV-1-Antigen. „Zusätzlich zu seinem Interesse für Benchmarking hat Rapamycin eine wichtige biomedizinische Relevanz, da es einer der ersten Modulatoren der Protein-Protein-Interaktion ist, die in die Klinik gelangt sind“, kommentierten die Forscher. Die Forscher beobachteten die Zyklen der Bindung und des Bruchs mithilfe eines Mikroskops. Sie verglichen ihre Ergebnisse auch mit denen etablierter Techniken wie magnetischer Pinzetten, um ihre Genauigkeit sicherzustellen.

Die Möglichkeit, dieselbe Protein-Protein-Bindung mehrmals testen zu können, ist wichtig, um Variationen zwischen molekular identischen Paaren zu untersuchen. Außerdem können Forscher damit untersuchen, wie sich diese Wechselwirkungen mit zunehmendem Alter der Moleküle verändern, was für die Bestimmung der Halbwertszeit von Arzneimitteln oder Antikörpern wichtig sein könnte. „… die Kombination von AFS und J-DNA hat das Potenzial, sowohl grundlegende Fragen zu beantworten als auch den Weg für eine systematische chemomechanische Charakterisierung biomedizinisch relevanter Wechselwirkungen zu ebnen“, stellten sie fest.

„Mit diesem Tool haben wir die Möglichkeit, tiefer zu gehen und experimentelle Ideen über molekulare Heterogenität und molekulare Alterung wirklich zu untersuchen“, sagte Limozin. „Wir und andere vermuten, dass die Charakterisierung dieser Eigenschaften für die Entwicklung zukünftiger Therapeutika, die in Situationen funktionieren müssen, in denen mechanische Kräfte im Spiel sind, sehr nützlich sein wird.“

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